Elisa小課堂：ELISA試劑盒酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定類型及操作過(guò)程

　　ELISA試劑盒雙抗體夾心法檢查抗原

　　雙抗體夾心法是檢查抗原zui常用的辦法，但要留意的是在一步法(待測(cè)抗原與酶標(biāo)抗體一同參加反響)測(cè)定中，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體，而不再構(gòu)成“夾心復(fù)合物"呈現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，乃至可不顯色而呈現(xiàn)假陰性成果。因而在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可反常增高的物質(zhì)(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)時(shí)，應(yīng)留意可測(cè)規(guī)模的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。 雙抗體夾心法測(cè)抗原的另一留意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子(RF)的攪擾。RF是一種本身抗體，多為IgM型，能和多種動(dòng)物IgG的Fc段。用作雙抗體夾心法檢查的血清標(biāo)本中如富含RF，它可充任抗原成份，一同與固相抗體和酶標(biāo)抗體，表現(xiàn)出假陽(yáng)性反響。雙抗體夾心法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能構(gòu)成兩位點(diǎn)夾心。

　　雙抗體夾心法的扼要操作過(guò)程為：

　　1)先參加抗體，使抗體固定于載體外表;

　　2)再加樣品，使目標(biāo)檢查抗原構(gòu)成抗原-抗體復(fù)合物;

　　3)加酶標(biāo)抗抗體(第二種動(dòng)物抗抗原的酶標(biāo)抗體);

　　4)參加酶促反響底物，發(fā)作顯色反響，顯色的深淺與待測(cè)抗原的量成正比。

　　ELISA試劑盒競(jìng)賽法檢查抗原

　　當(dāng)小分子抗原或半抗原因缺少可作夾心法的兩個(gè)以上的抗體位點(diǎn)，因而不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，能夠選用競(jìng)賽法形式。辦法的基本原理可見圖2，經(jīng)洗刷后分成兩組：一組加酶符號(hào)抗原和被測(cè)抗原的混合液，而另一組只加酶符號(hào)抗原，再經(jīng)孵育洗刷后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測(cè)定的不知道抗原的量。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。

　　競(jìng)賽法的扼要操作過(guò)程：

　　1)先參加抗體，使抗體固定于載體外表;

　　2)參加梯度濃度比例的待測(cè)樣品與酶標(biāo)抗原混合物,一同做只加酶標(biāo)抗原的對(duì)照組;

　　3)參加酶促反響底物，發(fā)作顯色反響，比照實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的顯色區(qū)別，計(jì)算不知道抗原的量。

　　雙抗原夾心法檢查抗體

　　雙抗原夾心法的反響形式與雙抗體夾心法相似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶物，以檢查相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不一樣之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因而其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢查常選用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原構(gòu)造的不一樣，尋覓適宜的符號(hào)辦法。

　　雙抗原夾心法的扼要操作過(guò)程為：

　　1)先參加抗原，使抗體固定于載體外表;

　　2)再加樣品，使目標(biāo)檢查抗體構(gòu)成抗原-抗體復(fù)合物;

　　3)加酶標(biāo)抗原;

　　4)參加酶促反響底物，發(fā)作顯色反響，顯色的深淺與待測(cè)抗體的量成正比。

　　間接法檢查抗體

　　間接法是檢查抗體常用的辦法。其原理為使用酶符號(hào)的抗抗體(辣根過(guò)氧化物酶符號(hào)的兔抗人免疫球蛋白抗體)以檢查與固相抗原的受檢抗體(人免疫球蛋白)，故稱為間接法。本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢查而進(jìn)行流行癥的確診。間接法的長(zhǎng)處是只需改換包被抗原就可使用同一酶標(biāo)抗抗體樹立檢查相應(yīng)抗體的辦法。

　　間接法的扼要操作過(guò)程：

　　1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)合，構(gòu)成固相抗原;

　　2)加稀釋的受檢血清，保溫反響。血清中的特異抗體與固相抗原，構(gòu)成固相抗原抗-體復(fù)合物;3)加酶標(biāo)抗抗體;

　　4)參加酶促反響底物，發(fā)作顯色反響，顯色的深淺與待測(cè)抗體的量成正比。

　　ELISA試劑盒競(jìng)賽法檢查抗體

　　競(jìng)賽法測(cè)抗體的反響形式與競(jìng)賽法測(cè)抗原相似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶物，以檢查相應(yīng)的抗體。當(dāng)抗原材料中的攪擾物質(zhì)不易除去，或不易得到滿足的純化抗原時(shí)，可用此法檢查特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)賽與固相抗原。標(biāo)本中抗體量越多，在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因而陽(yáng)性反響呈色淺于陰性反響。如抗原為高純度的，可直接包被固相。競(jìng)賽法測(cè)抗體有多種形式，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競(jìng)賽，抗HBc ELISA通常選用此法。另一種形式為將標(biāo)本與抗原一同參加到固相抗體中進(jìn)行競(jìng)賽，洗刷后再參加酶標(biāo)抗體，與在固相上的抗原反響。抗HBe的檢查通常選用此法。

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